GOX—CP4EPSP转化甘蓝型油菜的抗草甘膦研究

摘要：利用Genome walking方法在孟山都抗农达油菜（Brassica napus L.）中克隆了GOX-CP4EPSP双顺反子结构。利用农杆菌介导的遗传转化方法将PCAMBIA-GOX-CP4EPSP植物双元表达载体转化甘蓝型油菜PolCMS恢复系“7-5”获得转基因植株。在田间对转基因植株喷施400倍的农达（41%草甘膦异丙胺盐），所有的转基因家系都能存活，而非转基因PolCMS恢复系“7-5”全部死亡。在转基因植株叶片中能够检测到GOX和CP4EPSP基因的表达。对转基因T1代3个家系在60 mg/L草甘膦培养基上的发芽试验以及GUS染色分析表明抗草甘膦的单株能表达与GOX-CP4EPSP共转化的GUS蛋白质，而对草甘膦敏感的单株和野生型对照植株都不能表达GUS蛋白质。鉴于GOX-CP4EPSP双顺反子在转基因油菜中的有效性和稳定性，可以作为双子叶植物遗传转化的筛选标记。

关键词：油菜（Brassica napus L.）；GOX-CP4EPSP；双顺反子；草甘膦抗性；农达；筛选标记

中图分类号：S482.4 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2016）10-2661-06

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.10.053

Abstract： GOX-CP4EPSP Two-Cistron structure from Monsanto Roundup resistant Brassica napus L. was cloned by Genome walking Transgenic PolCMS restore line “7-5” with plant binary transformation vector PCAMBIA-GOX-CP4EPSP survived better under 400 time diluted solution with commercial glyphosate-containing 41% herbicide， while non-transgenic plants“7-5” died sprayed with the same diluted solution. In transgenic plants leaves， GOX and CP4EPSP stably expressed. Three transgenic T1 plant lines germination and growth in 60 mg/L glyphosate medium and GUS staining detection indicate glyphosate resistant plants show stable GUS expression， however glyphosate sensitive plants have no GUS activity assessed histochemically in X-Gluc solution. Due to the efficiency in transgenic Brassica napus L.， the use of GOX-CP4EPSP structure as a selectable marker provides an effective and alternative transformation selection system for dicot species.

Key words： Brassica napus L.； GOX-CP4EPSP； two-cistron； glyphosate resistance； roundup； selective marker

草甘膦（N-phosphonomethyl-glycine，Glyphosate）是一种内吸传导型广谱灭生性除草剂。1974年草甘膦作为除草剂在美国登记注册之后，孟山都公司推出了草甘膦异丙胺盐将其投放市场，商品名为农达（Roundup）[1]。目前，草甘膦是世界上应用最为广泛的农药品种[2-5]。

草甘膦被植物迅速吸收后随着同化产物输导到植物的整个器官中，对植物细胞分裂、叶绿素合成以及光合作用过程中的蛋白质代谢有着重要影响并导致植物死亡。根据草甘膦的抑制作用原理[6，7]，能使植物具有草甘膦抗性的方法有过量表达植物内源EPSP合酶；降解或者修饰解除草甘膦的抑制作用；在植物中转化并表达外源EPSP合酶[8]。在细菌中，EPSPs是由aroA基因所编码，大量抗草甘膦的aroA基因已被克隆，但只有少数基因被应用于商业化转基因抗除草剂作物中[9-12]。目前抗草甘膦的作物大多数是转入非敏感型的EPSP合酶基因，如从农杆菌（Agrobacterium sp.CP4）中分离出的EPSP合成酶，它对PEP具有较高的亲和性但对草甘膦不敏感，可以很好地替代植物内源的EPSP合成酶系统，保证莽草酸途径正常[13-15]。将CP4EPSP基因导入珂字棉312使其产生对草甘膦的抗性，是由于CP4EPSP合成酶竞争性与底物PEP结合从而产生草甘膦抗性[16]。对EPSP合酶基因实现突变能创造新的耐草甘膦EPSPs。鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella typhimurium）中的aroA基因是草甘膦作用靶标EPSP合成酶的编码基因，该基因中单个核苷酸所造成的氨基酸的变化（Pro101Ser）会使其与底物PEP和草甘膦的亲和性下降，但与后者的亲和性下降得更多，从而产生对草甘膦的抗性[17]。对aroA基因的多个氨基酸位点突变，以提高对PEP的亲和力而降低对草甘膦的亲和力可以优化对草甘膦的抗性[18]。对草甘膦敏感的植物和细菌的EPSP合酶中100位置的氨基酸是保守的Gly，当EPSP发生双突变（T971，P101S）会引起Gly移码到96位的草甘膦结合位点，从而产生草甘膦的耐受性[19]。水稻EPSP合酶基因出现P106L的突变能在大肠杆菌及转基因烟草中提高对草甘膦的抗性[20]。玉米中两个密码子的改变能提高玉米对草甘膦的耐受性[21]。在牛筋草的EPSPS发生突变P106S，能提高5倍草甘膦的耐受性[22]。草甘膦氧化-还原酶GOX（Glyphosate oxidoreductase）是一类以草甘膦为靶标的解毒抗性物质，它存在于植物中对草甘膦的降解作用比较缓慢，细菌的GOX对草甘膦的降解速度快，但是不能单独使用，所以和抗草甘膦的CP4共同使用。Barry等[23]从耐草甘膦的细菌中克隆了草甘膦氧化还原酶基因（GOX），该基因能够将草甘膦降解为氨甲基磷酸。将GOX基因和CP4EPSP基因转化到小麦后得到了抗草甘膦的植株，并且GOX和CP4EPSP基因成为小麦遗传转化试验中有效的筛选标记[24]。

推荐访问:甘蓝 油菜 转化 研究 GOX